Научный междисциплинарный журнал «ПАМ-research» Альянса Компетенций «Парк Активных Молекул» — сетевое издание, освещающее научно-исследовательскую деятельность по разработке и испытаниям перспективных оригинальных фармпрепаратов, проводимых АК ПАМ и его партнерами, а также учеными, которые могут стать потенциальными партнерами АК ПАМ. Каждый номер журнала посвящен изучению новых активных молекул, классов соединений или направлений и содержит статьи о разных этапах создания оригинального фармацевтического препарата.

Доклинические исследования безопасности Противовирусного средства ПАМ-1 (действующее вещество – Бенкармет)

Фармацевтика / Вопросы R&D Все статьи рубрики

Еримбетов К.Т, д.б.н.

Гончарова А., к.б.н.

Бондаренко Е., к.б.н.

Розиев Р.А., к.м.н.

 

ООО «Научно-исследовательский центр «Парк активных молекул», г.Обнинск

Ключевые слова: противовирусное средство, токсикология, лабораторные животные, фармацевтическая субстанция Бенкармет, общетоксические свойства, острая и хроническая токсичность, специфические виды токсичности, мутагенность, эмбриотоксичность, тератогенность, иммунотоксичность, канцерогенность, аллергизирующие свойства. 

 

Введение

 

Вирусные инфекции широко распространены в человеческой популяции и способны поражать практически все органы и системы организма хозяина, вызывая латентную, острую, хроническую и медленную формы инфекции. Высокая заболеваемость и смертность от вирусных инфекций диктует необходимость создания этиотропных лекарственных препаратов. Значительная часть регистрируемых заболеваний вирусной этиологии приходится на грипп, ОРВИ, в настоящее время на коронавирус. Разработка лекарственных препаратов с оригинальной химической структурой и механизмом действия призвана обеспечить решение проблемы терапевтической эффективности лечения гриппа, ОРВИ, коронавируса [1].

В течение ряда лет Научно-исследовательским центром «Парк активных молекул», г. Обнинск разрабатывается оригинальное противогриппозное средство с новой химической структурой и отличным механизмом действия. В качестве нового противогриппозного средства предлагается химическое соединение производное индолов [2, 3, 4]. Разрабатываемое средство зарегистрировано в Государственном реестре лекарственных средств РФ под названием Бенкармет (номер реестровой записи: ФС 000175 от 28.09.11). Фармацевтическая субстанция (ФС) Бенкармет представляет собой соединение 1-(6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометилиндол-3-ил)-4-бензилпиперазина гидрохлорид, молекулярная масса которого составляет 601. Фармацевтическая субстанция Бенкармет является действующим веществом экстемпорального лекарственного средства ПАМ-1 для предупреждения развития пневмонии, вызванной вирусами гриппа и других вирусных инфекций (ОРВИ, включая коронавирусы).

По данным разработчиков, Бенкармет препятствует проникновению вирусов в клетки эпителия, выстилающие бронхи и легкие, оставляя обездвиженный и недееспособный вирус на поверхности клетки, соответственно, болезнь не прогрессирует, а организм приобретает специфическую иммунологическую защиту. Биомишенью является белок вируса гриппа гемагглютинин (HA). Бенкармет, взаимодействуя с НА вируса, резко снижает его способность расширять «поры»  клеточных мембран, в результате чего вирус не может через них проникнуть внутрь клетки. Данные проведенных дополнительных исследований влияния Бенкармета на механические свойства липидных мембран в модели липидных нанотрубок показали, что препарат встраивается в бислойную липидную мембрану и приводит к значительному (в 3 раза) уменьшению изгибной жесткости последней. Это обеспечивает локальные топологические перестройки мембран эпителиальных клеток, что также существенно затрудняет вирусной частице возможность проникать через такую «гибкую» мембрану. Возбудитель, оставаясь на поверхности клеточной оболочки, позволяет выработать организму иммунитет к данному классу вирусов. Бенкармет также обладает интерферониндуцирующими свойствами, повышает устойчивость организма к вирусным инфекциям [5].

Прогнозировать безопасность и эффективность инновационных лекарственных препаратов для человека можно, только изучив их токсичность и фармакологическую активность в экспериментах на лабораторных животных. И.П. Павлов писал: «Чем полнее будет проведен опыт на животных, тем менее часто больным придется быть в положении опытного объекта со всеми печальными последствиями». Основными объектами для оценки токсичности и эффективности лекарственных средств являются экспериментальные животные: мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки, свиньи, а также в ряде случаев и обезьяны [6, 7].

Целью данной работы являлись доклинические токсикологические исследования противовирусного средства Бенкармет на лабораторных животных.

 

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка безопасности инновационного лекарственного препарата на стадии доклинических исследований должна включать в себя изучение на экспериментальных животных его общетоксического действия и специфических видов токсичности. Определяются органы, наиболее чувствительные к препарату (органы-мишени), дозовая зависимость выявленной патологии и степень ее обратимости [9, 16].

На основании полученных данных по токсикологическому профилю препарата рассчитывается безопасная доза для человека при проведении 1-й фазы клинических исследований, когда препарат назначается волонтеру впервые. На этой фазе клинических исследований необходимо проводить мониторинг функционального состояния тех органов, которые были определены как органы-мишени у животных. При проведении 2-й фазы клинических испытаний большое значение имеют результаты переносимости препарата волонтерами (1-я фаза клинических испытаний), а также анализ данных токсикологических исследований на животных с учетом патологических процессов, развивающихся у пациентов при соответствующих заболеваниях. Оцениваются соотношение ожидаемой пользы от применения препарата в клинике и риск возможных нежелательных реакций [6, 7].

К токсикологическим исследованиям относится оценка общей токсичности, гено- и эмбриотоксичности, влияния на репродуктивную способность и канцерогенной активности. Ценность токсикологических исследований на животных определяется возможностью установить зависимость между дозой вводимого вещества и эффектом, изучать эффекты, которые невозможно или сложно исследовать у человека, например, изменение структуры внутренних органов с использование гистологических методов, влияние препаратов на внутриутробное развитие плода и т.д.

Программа токсикологического исследования нового противовирусного средства Бенкармет включала изучение токсичности и переносимости препарата при однократном введении лабораторным животным, оценку токсичности в условиях хронических экспериментов на крысах.

Кроме того, было проведено изучение потенциальных мутагенных, эмбриотоксических, тератогенных, аллергизирующих и иммунотоксических свойств препарата, а также исследовано его влияние на репродуктивную функцию.

 

1 Общетоксические свойства

1.1 Острая токсичность

Изучение токсичности ФС Бенкармет при однократном внутрижелудочном введении проведено на 85 мышах линии BALB/c (самцы и самки, масса тела 18-20 г) и 40 крысах Wistar (самцы и самки, масса тела 185-210 г). Длительность наблюдения за подопытными животными после введения вещества составляла 14 суток.

Проведенные исследования показали, что однократное внутрижелудочное введение ФС Бенкармет в 1 % крахмальном геле мышам линии ВАLВ/с в дозах 500-5000 мг/кг и крысам Wistar в диапазоне доз 400-4000 мг/кг не вызывает признаков интоксикации и гибели животных. Введение в желудок мышам Бенкармета в дозах 8000-10000 мг/кг сопровождалось снижением двигательной активности, заторможенностью и гибелью животных. При внутрижелудочном введении ФС Бенкармет мышам линии ВАLВ/с ЛД50 установлена на уровне 9550±340 мг/кг для самок и 9800±300 мг/кг для самцов. При этом не выявлено существенных половых различий в чувствительности животных к токсическому действию препарата.

Введение ФС Бенкармет в желудок крысам Wistar в дозах выше 5000-6000 мг/кг не представлялось возможным по техническим причинам (образование вязкой суспензии с максимально возможным объемом жидкости при введении в желудок). В связи с этим не удалось зарегистрировать гибель этого вида животных. При этом максимальная из испытанных доз препарата - 6000 мг/кг более чем в 540 раз превышала высшую суточную терапевтическую дозу, рекомендованную для человека в качестве противогриппозного средства (800 мг/человека/сутки или 11 мг/кг).

Таким образом, ФС Бенкармет является малотоксичным веществом при однократном введении в желудок мышам линии BALB/c и крысам Wistar.

 

1.2 Хроническая токсичность

Изучение токсичности ФС Бенкармет в условиях хронического эксперимента проведено при ежедневном внутрижелудочном введении препарата крысам Wistar в течение 1 и 3 месяцев. Исследования выполнены на 90 крысах Wistar (самцы и самки, первоначальная масса тела 110-200 г), которые были разделены на 3 группы по 30 животных в каждой (15 самцов и 15 самок); I группа - контроль; II группа - Бенкармет, 110 мг/кг; III группа - Бенкармет, 220 мг/кг. Примененные дозы препарата соответственно в 10 и 20 раз превышали высшую суточную терапевтическую дозу, рекомендованную для человека в качестве противогриппозного средства (800 мг/человека/сутки или 11 мг/кг). Изучаемый препарат в испытанных дозах вводился ежедневно в желудок крысам в 1% крахмальном геле 1 раз в сутки в течение 3 месяцев. Животным контрольной группы вводилось соответствующее количество крахмального геля. На протяжении эксперимента фиксировали общее состояние и поведение животных (динамика массы тела, двигательная активность, аппетит, состояние шерстного покрова). До введения, а также через 1 и 3 месяца после начала введения препарата исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень общего белка, мочевины, креатинина, общего билирубина, глюкозы, холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа). Для определения указанных показателей у крыс брали кровь из хвостовой вены.

Результаты изучения хронической токсичности при внутрижелудочном ежедневном введении крысам Wistar обоего пола (первоначальная масса тела животных 125 - 130 г) в течение 1 месяца ФС Бенкармет в исследуемой дозах 110 мг/кг (10 - кратная высшая суточная доза) и 220 мг/кг (20 - кратная высшая суточная доза для человека) показали по сравнению с контрольной группой:

  • в экспериментальных группах при введении Бенкармета ежедневно в течение 1 месяца не наблюдалось достоверных различий в показателях по влиянию на общее состояние (внешний вид, и поведенческие реакции) и динамику массы тела экспериментальных животных по сравнению с контрольными животными;
  • в экспериментальных группах не отмечено негативного влияния на эритропоэз, изменения числа лейкоцитов в периферической крови, на содержание гемоглобина по сравнению с контрольными животными;
  • в экспериментальных группах по сравнению с контрольными животными не отмечено негативного влияния на уровень общего белка в сыворотке крови, что указывает на стабильность белоксинтезирующей функции печени;
  • в экспериментальных группах по сравнению с контрольными животными не отмечено негативного влияния на активность «печеночных» ферментов: аспартат- и аланинаминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, глюкозы, мочевины и креатинина.

             Результаты изучения хронической токсичности при внутрижелудочном ежедневном введении крысам Wistar обоего пола (первоначальная масса тела животных 190 – 210 г) в течение 3-х месяцев ФС Бенкармет в исследуемой дозах 110 мг/кг (10-кратная высшая суточная терапевтическая доза для человека) и 220 мг/кг (20-кратная высшая суточная терапевтическая доза для человека) показали по сравнению с контрольной группой:

  • в экспериментальных группах при введении Бенкармета ежедневно в течение 3-х месяцев не наблюдалось достоверных различий в показателях по влиянию на общее состояние (внешний вид и поведенческие реакции) и динамику массы тела экспериментальных животных по сравнению с контрольными животными;
  • в экспериментальных группах не отмечено негативного влияния на эритропоэз, изменения числа лейкоцитов в периферической крови, на содержание гемоглобина по сравнению с контрольными животными;
  • в экспериментальных группах по сравнению с контрольными животными не выявлено существенных изменений в уровне общего белка в сыворотке крови, что указывает на стабильность белковообразующей функции печени;
  • в экспериментальных группах по сравнению с контрольными животными не отмечено негативного влияния на активность «печеночных» ферментов: аспартат- и аланинаминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, глюкозы, мочевины и креатинина;
  • по результатам некропсии и гистологического исследования в экспериментальных группах при введении Бенкармета в исследуемых дозах в течение 3-х месяцев не было обнаружено развития дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов, а также местнораздражающего действия.

Таким образом, патологических изменений во внутренних органах и местнораздражающего действия у животных опытных групп под влиянием 3-месячного введения ФС Бенкармет в желудок в испытанных дозах 110 и 220 мг/кг не выявлено.

 

2 Специфические виды токсичности

2.1 Изучение мутагенных свойств

В настоящее время для изучения потенциальных мутагенных свойств разрабатываемых лекарственных препаратов применяется набор тестов, позволяющих выявлять указанные нежелательные побочные эффекты изучаемых препаратов.

В соответствии с методическими рекомендациями в систему исследования лекарственных и биологически активных препаратов для выявления среди них потенциальных мутагенов включен набор методов, с помощью которых можно зарегистрировать мутации различных типов - хромосомные аберрации, генные мутации, а также суммарно все типы повреждений в половых клетках млекопитающих. При изучении мутагенности Бенкармета в лаборатории лекарственной токсикологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий» были проведены следующие исследования:

  • учет генных мутаций на микроорганизмах в тесте Эймса;
  • учет доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей;
  • учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих.

Оценка мутагенной активности Бенкармета проведена методом учета способности вещества индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro и без системы метаболической активации. Использован чашечный метод учета мутаций, предложенный Ames et al. (1972, 1984) в модификации, описанной в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [8].

В качестве индикаторных микроорганизмов были использованы ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonella typhimurum ТА98, ТА100 и ТА1537. Наличие мутагенного действия препарата оценивалось по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Штамм ТА98 несет мутацию his D03052.

При проведении теста Эймса были использованы концентрации препарата от 0,1 до 1000 мкг/чашку. Бенкармет растворялся в ДМСО в концентрации 10 мг/мл, дальнейшие разведения готовились на ДМСО и вносились на чашки Петри. В качестве контроля был использован ДМСО.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что Бенкармет в концентрациях 0,1-1000 мкг/чашку не вызывает увеличения количества ревертантов, т.е. не обладает мутагенным действием в тесте Эймса на штаммах Salmonella typhimurum ТА98, ТА100 и ТА1537.

Как указывалось выше, оценка потенциального мутагенного свойства ФС Бенкармет реализовывалась в экспериментах по изучению доминантных летальных мутаций в половых клетках самцов, обработанных препаратом, на разных стадиях сперматогенеза у мышей-гибридов F1 (СВАхС57ВI6).

Самцам вводился Бенкармет внутрижелудочно однократно, в 1% крахмальном геле в дозе 550 мг/кг, что соответствовало 50-кратной суточной дозе для человека (11 мг/кг). Животным контрольной группы вводился внутрижелудочно 1 % крахмальный гель в том же объеме. В опытной и контрольной группах было по 15 самцов. После введения препарата к каждому самцу были подсажены по 3 интактных виргинных самки. Через каждые 7 дней самки отсаживались, заменялись новыми. Отсаженные самки  вскрывались на 16 день беременности, производился учет количества живых и мертвых эмбрионов. Повышенная эмбриональная смертность плодов у самок, забеременевших в первую неделю после введения препарата, свидетельствует о мутационных изменениях в зрелых спермиях, во вторую неделю - в поздних сперматидах, в третью - в ранних сперматидах. Результаты вскрытия фиксировались для каждой самки отдельно, затем суммировались. Основным показателем уровня доминантных летальных мутаций служил уровень постимплантационных потерь - показатель, характеризующий постимплантационную выживаемость.

Как показывают проведенные исследования, уровень постимплантационных потерь у животных, подвергавшихся воздействию Бенкармета однократно внутрижелудочно, в дозе 550 мг/кг, равной 50-кратной высшей суточной терапевтической для человека (800 мг/человека/сутки или 11 мг/кг), ни на одной из стадий сперматогенеза не превышает показателей у контрольных животных.

Цитогенетическая активность Бенкармета изучалась методом учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей.Сущность данного метода заключается в оценке влияния введенного в организм животных испытуемого вещества на генетический аппарат клеток костного мозга, чувствительный к воздействиям химических веществ. Эксперименты проведены на мышах гибридах F1 (СВАхС57ВI6) массой 18-20 г. Самцам вводилась взвесь Бенкармета в 1% крахмальном геле в желудок однократно в дозе 550 мг/кг, что соответствовало дозе, равной 50-кратной высшей терапевтической для человека (11 мг/кг). Животным контрольной группы вводился 1% крахмальный гель в том же объеме. Параллельно проводили подострый эксперимент при внутрижелудочном введении Бенкармета в дозе 110 мг/кг, т.е. из расчета 10-кратной высшей терапевтической дозы для человека, ежедневно на протяжении 5 дней. В этом случае животные забивались через 6 ч после последнего введения препарата. В опытном и контрольном вариантах использовано по 5 животных. За 1 час до вскрытия мышам внутрижелудочно вводился колхицин (фирмы "Serva") в дозе 4,8 мкг/г массы тела животного.

Из экспериментальных данных следует, что статистически достоверных различий в уровне хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, подвергавшихся воздействию Бенкармета в испытанных дозах по сравнению с контролем, не установлено. Следовательно, по примененному тесту учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих Бенкармет не обладает мутагенной активностью.

Следует подчеркнуть, что в соответствии с "Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" [8] и "Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств" [9] использованные методы учета мутаций являются первым этапом оценки канцерогенности, и в случае получения отрицательных результатов дальнейшее изучение канцерогенных свойств препарата не целесообразно в связи с малой вероятностью обнаружения нежелательной активности

Таким образом, по данным изучения способности Бенкармета вызывать генные мутации у индикаторных штаммов бактерий в тесте Эймса, хромосомные аберрации в клетках костного мозга млекопитающих и влиять на количество доминантных леталей в зародышевых клетках мышей, мутагенной активности данного препарата не выявлено и можно прогнозировать отсутствие у него канцерогенных свойств.

 

2.2 Эмбриотоксические и тератогенные свойства

Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств Бенкармета проведено в соответствии с методическими рекомендациями, опубликованными в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [8].

Эксперименты проведены на 40 беременных крысах линии Wistar, которые были разделены на 2 группы по 20 животных в каждой: 1-группа - контроль, 2-группа - Бенкармет (в дозе 110 мг/кг, что составляет 10-ти кратную максимальную суточную терапевтическую дозу для человека).

Препарат в 1% крахмальном геле вводился животным внутрижелудочно ежедневно с 1 по 19 день беременности 1 раз в сутки в дозе 110 мг/кг. Животным контрольной группы вводился внутрижелудочно соответствующие объемы 1% крахмального геля.

На 20-й день беременности была проведена эвтаназия 70% беременных крыс дислокацией шейных позвонков с последующим исследованием костного скелета и внутренних органов плодов, а также для определения показателей предимплантационной и постимплантационной гибели. После оценки жизнеспособности плодов, определения их массы, был проведен анализ внешних аномалий (подкожные кровоизлияния, отек подкожной клетчатки) и пороков развития (искривление конечностей и позвоночного столба, изменения глазных яблок, ушных раковин). После наружного осмотра плодов, одна группа плодов (примерно 2/3) фиксирована в 96% спирте и после просветления раствором щелочи, промывания водой, окрашены ализарином, обезвожены в различных смесях глицерина с 96% спиртом и использована для изучения костного скелета по Доусону. Другая группа плодов (примерно 1/3) была фиксирована в жидкости Буэна и использована для изучения внутренних органов на микроанатомических срезах по Вильсону-Дыбану (на уровне вибрисс, глазных яблок, боковых и четвертого желудочков головного мозга, выше передних лап, ниже передних лап, на уровне сердца и легких, желудка, печени, почек) исследованы также мочевой пузырь, мочеточники и органы репродуктивной системы. 30% от общего количества беременных самок было оставлено на роды, после которых в течение первого месяца постнатального периода проведено изучение смертности, динамики массы тела и физического развития крысят.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что Бенкармет в испытанной дозе 110 мг/кг (10-кратная максимальная терапевтическая доза для человека) при внутрижелудочном введении беременным крысам с 1 по 19 день гестации не влияет на динамику массы тела беременных крыс и продолжительность беременности. Не установлено влияния препарата на показатели эмбриотоксичности (количество живых плодов, показатели пред- и постимплантационной гибели, масса тела эмбрионов, их кранио-каудальный размер и др.) и постнатальное развитие крысят, не выявлено влияния препарата на количество родившихся крысят. Динамика массы тела крысят на протяжении первого месяца жизни не отличалась от соответствующих показателей в контроле. Показатели смертности крысят, подвергавшихся в пренатальном периоде развития воздействию исследуемого препарата в изучаемой дозе, также не отличались от контрольных. Развитие потомства в течение всего периода наблюдения по другим принятым параметрам (покрытие шерстью, появление резцов, открытие глаз, отлипание ушных раковин, открытие вагины, опускание яичек, время созревания рефлексов и др.) происходило без отклонения от сроков, характерных для нормального физиологического развития животных этого вида. В испытанной дозе препарат не вызывал каких-либо уродств и пороков развития эмбрионов.

Таким образом, ФС Бенкармет в испытанной дозе 110 мг/кг не обладает эмбриотоксичностью и тератогенностью.

 

2.3  Изучение влияние Бенкармета на репродуктивную функцию

Исследования выполнены на 90 самках и самцах крыс линии Wistar (исходная масса тела 180 - 200 г). Препарат в 1% крахмальном геле вводился внутрижелудочно в дозе 110 мг/кг, что соответствует 10-ти кратной максимальной терапевтической суточной дозе для человека. Группа самок, состоящая из 60 животных, была разделена на 2 подгруппы: контрольную (40 животных) и опытную (20 животных). Самкам опытной подгруппы ежедневно в течение 2 недель (3-4 эстральных цикла) внутрижелудочно вводился Бенкармет. Группа самцов, состоящая из 30 животных, была разделена на 2 подгруппы: контрольную (20 животных) и опытную (10 животных). Самцам опытной подгруппы ежедневно в течение 10 недель (2-3 - цикла созревания сперматозоидов) также внутрижелудочно вводился Бенкармет. Животным контрольной подгруппы в те же сроки вводилось соответствующее количество 1% крахмального геля, используемого для приготовления суспензии препарата. Препарат вводили 1 раз в сутки в дозе 110 мг/кг.

После окончания введения препарата было сформировано три группы животных:

  • первая - к 10 контрольным самцам подсаживали 20 контрольных самок;
  • вторая (Бенкармет) - к 10 контрольным самцам подсаживали 20 опытных самок;
  • третья (Бенкармет) - к 10 опытным самцам подсаживали 20 контрольных самок.

В течение двух эстральных циклов просматривались вагинальные мазки. Отмечались стадии проэструс, эструс, метаэструс и диэструс. Обнаружение в вагинальных мазках сперматозоидов считалось первым днем беременности. По истечении 10 суток из беременных самок в каждой из трех групп создавались две подгруппы. Первые подгруппы самок забивались на 20 день беременности. Подсчитывалось количество плодов, резорбций, мест имплантации в полости матки, желтых тел в яичниках. На основании полученных данных вычислялись показатели предимплантационной и постимплантационной гибели, а также индекс плодовитости и индекс беременности. При осмотре плодов регистрировались патологические изменения (подкожные кровоизлияния и отек подкожной клетчатки, нарушения развития скелета, глазных яблок). Вторые подгруппы беременных самок оставлялись на роды, 1 раз в неделю проводилось их взвешивание, и отмечалась прибавка массы тела. Фиксировались даты родов, количество крысят в помете и массы тела новорожденных крысят. На 4, 7, 14, 21 сутки со дня родов вычислялся процент выживаемости, отмечался общий и средний вес крысят.

В результате проведенных исследований установлено, что внутрижелудочное введение Бенкармета в дозе 110 мг/кг, что составляет 10-ти кратную максимальную суточную терапевтическую дозу, рекомендованную для человека, не оказывает влияния на половую активность животных. Такие показатели репродуктивности, как количество живых плодов, масса тела эмбрионов, их кранио-каудальный размер, количество желтых тел, мест имплантации, резорбций, показатели пред- и постимплантационной гибели в опытных группах не отличались от показателей контрольной группы. Показатели постнатального развития (количество родившихся крысят на одну самку, масса тела новорожденных крысят, постнатальная смертность крысят, динамика массы тела крысят в течение 3-х недель постнатального развития) в опытных и контрольной группах не отличались.

Следовательно, ФС Бенкармет в исследуемой дозе 110 мг/кг не влияет на репродуктивную функцию здоровых половозрелых крыс.

 

2.4  Аллергизирующие свойства

Исследование аллергизирующих свойств Бенкармета проведено в соответствии с рекомендациями ВОЗ [10] и "Методическими указаниями по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ" Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. [8].

Исследование анафилактогенной активности Бенкармета выполнено на 15 пестрых морских свинках (самцы, масса тела 270-320 г), разделенных на 3 группы по 5 животных в каждой: 1 группа - контроль, 2 группа - Бенкармет 11 мг/кг, 3 группа - Бенкармет 110 мг/кг. Введение препарата внутрижелудочное в 1% крахмальном геле, контрольной группе вводился внутрижелудочно 1% крахмальный гель. Использованные дозы препарата соответствовали высшей и 10-кратной суточной дозе, рекомендованной для человека.

Животные были сенсибилизированы 5-кратным с интервалом в 1 день внутрижелудочным введением Бенкармета в указанных выше дозах. Тест-введения (разрешающие дозы) Бенкармета 110 мг/кг вводились морским свинкам на 14 и 21 сутки после последней сенсибилизации.

Проведенные исследования показали, что Бенкармет в разрешающей дозе 110 мг/кг при внутрижелудочном введении как на 14, так и на 21 сутки сенсибилизации не вызывает анафилактического шока.

Изучение реакции гиперчувствительности замедленного типа были проведенына 3 группах пестрых морских свинках (самцы, масса тела 250-300 г) по 5 животных в каждой: 1 группа - контроль, 2 группа - Бенкармет 11 мг/кг, 3 группа - Бенкармет 110 мг/кг.

Животные были сенсибилизированы 5-кратным с интервалом в 5 суток внутрижелудочным введением препарата в 1% крахмальном геле в изучаемых дозах. Морским свинкам контрольной группы вводился внутрижелудочно 1% крахмальный гель. Испытанные дозы изучаемого препарата соответствовали высшей и 10-кратной суточной терапевтической дозе, рекомендованной для человека. На 10-е сутки после последней сенсибилизации у животных на коже спины выстригался участок размером 3x3 см и накожно наносился по 0,1 мл суспензий препарата, использованных для сенсибилизации. На соседний выстриженный участок такого же размера наносился 1% крахмальный гель в том же объеме. Учет реакции проводился визуально по шкале кожных проб Г.В. Суворова через 4 и 24 часа после нанесения разрешающей дозы.

Как показали результаты исследований, ни в одном случае не наблюдалось гиперемии, признаков отека или воспаления, следовательно, Бенкармет не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок.

Кроме вышеприведенных тестов для оценки аллергизирующих свойств Бенкармета был использован метод изменения массы и клеточности подколенного лимфоузла у мышей в ответ на антигенный раздражитель, так называемый "popliteal lymph node assay" (PLNA ) [11].

Исследования проведены на 10 мышах-гибридах F1 (СВАxC57BI6) (самцы, масса тела 18-20 г), которым в подушечку правой задней лапы вводился 50 мкл физиологического раствора (контроль). В подушечку контралатеральной лапы был инъецирован 0,05 мл (110 мг/кг) Бенкармета в физиологическом растворе. Через 7 дней у мышей была определена клеточность правого и левого подколенных лимфоузлов, вычислен относительный индекс путем деления показателей левого лимофоузла на аналогичные показатели правого лимфоузла.

Проведенные исследования показали, что субплантарное введение Бенкармета не вызывает увеличения клеточности подколенного лимфоузла у мышей, что свидетельствует об отсутствии аллергенного потенциала у данного препарата. При этом относительный индекс клеточности подколенных лимфоузлов опытной и контрольной лап составляет 1,09. Следовательно, Бенкармет не обладает аллергизирующими свойствами при оценке влияния препарата на клеточность подколенных лимфоузлов у мышей.

Таким образом, при изучении аллергизирующих свойств на морских свинках установлено, что при 5-кратном внутрижелудочном введении препарата в сенсибилизирующих дозах 11 и 110 мг/кг и внутрижелудочном введении разрешающей дозы препарата (110 мг/кг) на 14 и 21 сутки после сенсибилизации Бенкармет не вызывает анафилактического шока. Препарат в испытанных дозах и схемах сенсибилизации не проявляет аллергизирующего действия в реакции гиперчувствительности замедленного типа на морских свинках и в реакции подколенного узла у мышей.

 

2.5 Иммунотоксические свойства

Изучение возможных иммунотоксических свойств Бенкармета проведено в соответствии с рекомендациями ВОЗ [10] и "Методическими указаниями по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ" Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. [8, 9]. Исследование влияния Бенкармета на гуморальный иммунный ответ изучено с помощью метода определения числа антителообразующих клеток в селезенке по Ерне. Влияние Бенкармета на клеточный иммунитет исследовано с помощью реакции гиперчувствительности замедленного типа. Также, согласно  рекомендациям Рабочего совещания в Арлингтоне [12], было изучено влияние препарата на клеточность селезенки на фоне антигенного стимула.

 

Влияние Бенкармета на число антителообразующих клеток в селезенке

Для изучения влияния ФС Бенкармета на число антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей был использован прямой метод локального гемолиза, который позволяет определить клетки, образующие иммуноглобулин М - антитела с высокой гемолитической активностью.

Исследования проведены на 35 мышах - гибридах F1 (СВАxC57BI6) (самцы, масса тела 18-20 г), которые были разделены на 7 групп по 5 животных в каждой. Мыши были иммунизированы внутривенным введением эритроцитов барана (ЭБ), отмытых в стерильном физиологическом растворе, в оптимальной иммуногенной дозе 5х108 клеток/мышь. Мышам групп 1 и 2 за сутки до иммунизации ЭБ (день"-1") вводился в желудок Бенкармет в 1% крахмальном геле, соответственно в дозах 110 и 220 мг/кг. Мышам групп 3 и 4 вводился препарат в дозах 110 и 220 мг/кг соответственно в день иммунизации (через 1 час после иммунизации, день "0"). Животным групп 5 и 6 вводился внутрижелудочно Бенкапрмет в дозах 110 и 220 мг/кг соответственно через 24 часа после иммунизации ЭБ (день "+1"). Контрольным мышам в день «+1» вводились внутрижелудочно соответствующие количества 1% крахмального геля (группа 7). Испытанные дозы препарата в 10 и 20 раз превышали высшую суточную дозу, рекомендованную для человека. На 4 сутки после иммунизации было определено число АОК в селезенке мышей по методу Ерне.

Результаты опытов показали, что в использованных дозах и схеме иммунизации Бенкармет не оказывает существенного влияния на число АОК в селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана, и, следовательно, не влияет на первичный иммунный ответ.

 

Влияние Бенкармета на количество ядросодержащих клеток в селезенке мышей

Эксперимент по оценке влияния Бенкармета на количество ядросодержащих клеток в селезенке мышей проведены на 35 мышах линии F1 (СВАxC57BI6) (самцы, масса тела 18-20 г), которые были разделены на 7 групп по 5 животных в каждой. Мыши были иммунизированы  внутривенным введением эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 5х108 клеток/мышь. Мышам групп 1 и 2 за сутки до иммунизации ЭБ (день"-1") Бенкармет вводился в желудок в 1% крахмальном геле, соответственно в дозах 110 и 220 мг/кг. Мышам групп 3 и 4 препарат вводился в дозах 110 и 220 мг/кг соответственно в день иммунизации (через 1 час после иммунизации, день "0"). Животным групп 5 и 6 Бенкармет вводился внутрижелудочно в дозах 110 и 220 мг/кг соответственно через 24 часа после иммунизации ЭБ (день "+1"). Мышам контрольной группы в день «+1» вводились внутрижелудочно соответствующие количества 1% крахмального геля (группа 7). Испытанные дозы препарата в 10 и в 20 раз превышали высшую суточную дозу, рекомендованную для человека. На 4 сутки после иммунизации мыши были забиты дислокацией шейных позвонков, извлекалась и взвешивалась селезенка, и определялось в ней количество ядросодержащих клеток.

Результаты исследования показали, что однократное введение Бенкармета в желудок мышам в испытанных дозах 110 и 220 мг/кг за день до иммунизации, в день иммунизации и через 1 сутки после иммунизации не влияет на клеточность селезенки.

 

Влияние Бенкармета на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей

Изучение влияния Бенкармета на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей было проведено на 35 мышах-гибридах F1 (СВАxC57BI6) (самцы, масса тела 18-20 г), которые были разделены на 7 групп, по 5 животных в каждой. Мыши были иммунизированы подкожным введением в межлопаточную область эритроцитов барана в дозе 2х10е клеток/мышь. Мышам групп 1 и 2 за сутки до иммунизации ЭБ (день"-1") вводился в желудок Бенкармет в 1% крахмальном геле, соответственно в дозах 110 и 220 мг/кг. Мышам групп 3 и 4 препарат вводился в дозах 110 и 220 мг/кг соответственно в день иммунизации (через 1 час после иммунизации, день "0"). Животным групп 5 и 6 Бенкармет вводился  внутрижелудочно в дозах 110 и 220 мг/кг соответственно через 24 часа после иммунизации ЭБ (день "+1"). Мышам контрольной группы в день «+1» вводились внутрижелудочно соответствующие количества 1% крахмального геля (группа 7). Испытанные дозы ФС Бенкармет в 10 и в 20 раз превышали высшую суточную дозу, рекомендованную для человека. На 5-е сутки после иммунизации всем животным была введена субплантарно в левую заднюю лапу разрешающая инъекция ЭБ в дозе 1х108 клеток/мышь в объеме 50 мкл («опытная лапа»). В подушечку контралатеральной лапы («контрольная лапа») было инъецировано 50 мкл стерильного физиологического раствора. Результаты реакции регистрировались через 24 часа путем взвешивания «контрольной» и «опытной» лап. Разница в массе «опытной» и «контрольной» лап характеризовала величину отека и интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что Бенкармет в испытанных дозах 110 и 220 мг/кг и схемах введения не влияет на формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа и, соответственно, на клеточный иммунитет.

Таким образом, в испытанных дозах 110 и 220 мг/кг (10- и 20-кратная высшая суточная терапевтическая доза, рекомендованная для человека) Бенкармет не влияет на число антителобразующих и ядросодержащих клеток в селезенке мышей, а также на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии влияния Бенкармета на гуморальный и клеточный иммунитет, и, следовательно, об отсутствии у препарата иммунотоксичности.

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать Бенкармет на клинические испытания.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги токсикологического изучения Бенкармета, предложенного в качестве нового противовирусного лекарственного средства, можно отметить, что препарат является малотоксичным при однократном внутрижелудочном введении мышам линии ВАLВ/С и крысам Wistar.

Проведенные исследования показали, что однократное внутрижелудочное введение Бенкармета в 1 % крахмальном геле мышам линии ВАLВ/С дозах 500-5000 мг/кг и крысам Wistar в диапазоне доз 400-4000 мг/кг не вызывает признаков интоксикации и гибели животных. Введение в желудок мышам Бенкармета в дозах 8000-10000 мг/кг сопровождалось снижением двигательной активности, заторможенностью и гибелью животных. При внутрижелудочном введении Бенкармета мышам линии ВАLВ/С ЛД50 установлена на уровне 9550-9800 мг/кг. При этом не выявлено существенных половых различий в чувствительности животных к токсическому действию препарата,

Введение Бенкармета в желудок крысам Wistar в дозах выше 5000-6000 мг/кг не представлялось возможным по техническим причинам (образование вязкой суспензии и максимально допустимым объемам жидкости при введении в желудок). В связи с этим не удалось зарегистрировать гибель этого вида животных. При этом максимальная из испытанных доз препарата - 6000 мг/кг более чем в 540 раз превышала высшую суточную терапевтическую дозу, рекомендованную для человека (800 мг/человека/сутки или 11 мг/кг).

Изучение токсичности Бенкармета в условиях хронических экспериментов проведено на крысах при ежедневном в течение 3-х месяцев внутрижелудочном введении препарата в дозах 110 и 220 мг/кг. Испытанные в хронических опытах на крысах дозы препарата превышали его высшую суточную терапевтическую дозу для человека (800 мг/человека/сутки или 11 мг/кг) в 10 и 20 раз.

Как показали проведенные исследования, Бенкармет в испытанных дозах 110 и 220 мг/кг в 3-месячном хроническом эксперименте на крысах хорошо переносится животными и не влияет на гематологические показатели, функциональное состояние основных органов и систем организма подопытных животных (по данным использованных биохимических тестов и ЭКГ). Отсутствие токсических повреждений внутренних органов и местнораздражающего действия, связанных с влиянием Бенкармета, было подтверждено результатами патоморфологических исследований, проведенных после окончания хронических экспериментов.

При исследовании мутагенных свойств Бенкармета изучена его способность вызывать генные мутации у индикаторных штаммов бактерий в тесте Эймса, вызывать хромосомные аберрации в клетках костного мозга млекопитающих и влиять на количество доминантных леталей в зародышевых клетках мышей. В результате проведенных исследований установлено, что Бенкармет не обладает мутагенными свойствами.

Исследование эмбриотоксичности и тератогенности показало, что Бенкармет в испытанной дозе 110 мг/кг (10-кратная максимальная суточная терапевтическая доза для человека) при внутрижелудочном введении беременным крысам с 1 по 19 сутки гестации не влияет на прибавку массы тела беременных крыс, продолжительность беременности, количество мест имплантации и живых плодов, а также на величины пред- и постимплантационной гибели, процессы оссификации костного скелета эмбрионов, прибавку массы тела крысят в течение первых 3 недель постнатального развития.

Введение Бенкармета во время беременности не влияет на количество родившихся крысят и показатели постнатальной смертности.

В испытанной дозе Бенкармет не вызывает каких-либо уродств или пороков развития и, следовательно, не обладает тератогенностью.

В испытанной дозе 110 мг/кг Бенкармет не влияет на репродуктивную функцию половозрелых крыс Wistar.

При изучении аллергизирующих свойств на морских свинках установлено, что при 5-кратном внутрижелудочном введении препарата в сенсибилизирующих дозах 11 и 110 мг/кг и внутрижелудочном введении разрешающей дозы препарата (110 мг/кг) на 14 и 21 дни после сенсибилизации Бенкармет не вызывает анафилактического шока. Препарат в испытанных дозах и схемах сенсибилизации не проявляет аллергизирующего действия в реакции гиперчувствительности замедленного типа на морских свинках и в реакции подколенного узла у мышей.

В испытанных дозах 110 и 220 мг/кг (10- и 20-кратная высшая суточная терапевтическая доза, рекомендованная для человека) Бенкармет не влияет на число антителобразующих и ядросодержащих клеток в селезенке мышей, а также на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии влияния Бенкармета на гуморальный и клеточный иммунитет, и, следовательно, об отсутствии у препарата иммунотоксичности.

Результаты проведенных исследований позволили рекомендовать новое противовирусное средство Бенкармет на клинические испытания.

Выражаем огромную благодарность и признательность руководителю лаборатории лекарственной токсикологии Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий» профессору Е.В. Арзамасцеву и его сотрудникам за помощь в проведении доклинических токсикологических исследований.

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ:

1. Кенес Еримбетов, Екатерина Бондаренко, Елена Калашникова, Анна Гончарова. Исследование токсичности оригинального противогриппозного препарата Бенкармет при однократном введении мелким лабораторным животным // Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием «Химическая безопасность и токсикология на стыке областей наук». Кишинев, 2016. С. 23-25.

2.   Воробьев И.В., Хомиченок В.В., Подгородниченко В.К., Цыб А.Ф., Розиев Р.А., Гончарова А.Я. Клатратные комплексы бета-циклодекстрина с 1-{[6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-н-индол-3-ил]карбонил}-4-бензилпиперазином, обладающие противовирусной активностью, их получение и применение// Патент на изобретение РФ № 2448120. Опубликовано  20.04.2012 Бюл. №11.

3.   Подгородниченко В.К., Цыб А.Ф., Розиев Р.А., Гончарова А.Я. Средство против вируса гриппа В // Патент на изобретение РФ № 2435582. Опубликовано  10.12.2011 Бюл. №34.

4.   Верховский Ю. Г., Цышкова Н.Г., Розиев Р.А., Цыб А.Ф., Гончарова А.Я., Трофимов Ф.А. Производные 5-замещенных индол-3-карбоновой кислоты, обладающие противовирусной активностью, способ их получения и применение // Патент на изобретение РФ № 2387642. Опубликовано  27.04.2010 Бюл. №12.

5.   Подгородниченко В.К., Цыб А.Ф., Розиев Р.А., Гончарова А.Я., Цышкова Н.Г., Еримбетов К.Т. Интерферониндуцирующее средство для лечения острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ)//Патент на изобретение РФ № 2470634. Опубликовано  27.12.2012 Бюл. №36.

6.   Безопасность лекарств: от доклиники к клинике: монография / Т.А. Гуськова, А.Л. Хохлов, Б.К. Романов, Р.Н. Аляутдин, О.А. Синицина, С.А. Спешилова, М.К. Корсаков, Т.Н. Николаева, С.В. Романова, Н.В. Чудова; под ред. А.Л. Хохлова. – Москва-Ярославль: ООО «Фотолайф», 2018, - 275 с.

7.   Еримбетов К.Т., Земляной Р.А., Федорова А.В. Доклинические исследования инновационных лекарственных средств для медицинского применения: опыт и практика// Научный междисциплинарный журнал «ПАМ-research». - № 2 (декабрь). – 2019. – С. 1-22. http://pam-r.com/archive/2a/52-pam2-erimbetov.

8.   Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева.-2-изд., перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005.- 832 с.: ил.

9.   Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Под ред. А.Н. Миронова – М.: Гриф и К, 2012. – 944 с.

10. Principes and methods for assessing direct immunotoxicity associated with exposure to chemicals. Enviromental Health Criteria, Vol.180 WHO, 1996.

11. Descotes J, Verdier F., Popliteal lymph node assay. In Methods in immunotoxicity. Vol.1, (eds. Burlenson J.R., Dean J.N., Munson A.E.), Wiley – Liss inc., 1995, pp.189-196.

12. Neuman D.A. Immunotoxicity testing and risk asessment: Summary of 1994 Workshop Immunology Technical Committee.-Fd Chem.Toxic,1995, Vol 33, №10, рр. 887-894.

Скачать статью (394 КБ)