Научный междисциплинарный журнал «ПАМ-research» Альянса Компетенций «Парк Активных Молекул» — сетевое издание, освещающее научно-исследовательскую деятельность по разработке и испытаниям перспективных оригинальных фармпрепаратов, проводимых АК ПАМ и его партнерами, а также учеными, которые могут стать потенциальными партнерами АК ПАМ. Каждый номер журнала посвящен изучению новых активных молекул, классов соединений или направлений и содержит статьи о разных этапах создания оригинального фармацевтического препарата.

Доклинические исследования инновационных лекарственных средств для медицинского применения: опыт и практика

Фармацевтика / Вопросы R&D Все статьи рубрики

Еримбетов Кенес Тагаевич, д.б.н.
Земляной Р.А., аспирант
Федорова А.В., аспирант

ООО «Научно-исследовательский центр «Парк активных молекул», г.Обнинск

Ключевые слова: доклинические исследования, лабораторные животные, токсикологические исследования, фармакологическая безопасность, фармакокинетические исследования, фармакодинамика, инновационный лекарственный препарат

Поскольку цель бизнеса – создавать клиентов,
у менеджмента остались только две
основные функции: инновации и маркетинг;
всё остальное – рутина, создающая издержки.
P. F. Drucker
New Management Paradigm, 1996.

Введение

Стремление к сохранению здоровья населения, увеличению продолжительности жизни и улучшению ее качества является основным вектором развития биологии, медицины и системы здравоохранения в развитых странах. Наличие современных доступных лекарственных препаратов определяет основу лечения и профилактики подавляющего большинства болезней современного человека и показателем социального и экономического развития общества. Создание и внедрение новых высокоэффективных лекарственных средств является приоритетной задачей ученых, технологов, врачей и государственных органов здравоохранения [1].
Достижения современной науки позволяют разрабатывать и использовать для получения новых лекарственных препаратов самые передовые технологии. Однако успешное внедрение в клиническую практику новых методов лекарственного лечения предполагает наличие доказанной в соответствии с современными требованиями высокой степени эффективности и безопасности применения новых лекарств. Для этого должен выполняться определенный порядок проведения научных исследований на различных уровнях, важнейшим из которых является оценка специфической фармакологической активности и безопасности на этапе доклинических экспериментальных исследований [1,2,3]. В Федеральном законе РФ № 61 «Об обращении лекарственных средств» определено, что доклиническое исследование лекарственного средства для медицинского применения проводится путем применения научных методов оценок в целях получения доказательств безопасности, качества и эффективности лекарственного средства [4].
Проводятся доклинические исследования на животных, чтобы минимизировать вероятность неблагоприятных реакций при испытании на людях. Именно доклиническое исследование дает возможность определить показания к применению препаратов, противопоказания и побочные эффекты, чтобы в дальнейшем определиться с объемом клинических испытаний и самой возможностью их проведения. Доклиническое исследование лекарственного средства для медицинского применения проводится в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, утвержденными уполномоченным федеральным органом исполнительной власти [5, 6].
Результаты доклинических исследований лекарственных средств необходимо представить с целью регистрации или проведения клинических исследований лекарственного препарата в РФ [1, 4].

Общие принципы проведения доклинических исследований

Прогнозировать безопасность и эффективность инновационных лекарственных препаратов для человека можно только изучив их токсичность и фармакологическую активность в экспериментах на лабораторных животных. И. П. Павлов писал: «Чем полнее будет проведен опыт на животных, тем менее часто больным придется быть в положении опытного объекта со всеми печальными последствиями». Основными объектами для оценки токсичности и эффективности лекарственных средств являются экспериментальные животные: мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки, свиньи, а также в ряде случаев и обезьяны [7].
Международный комитет по лабораторным животным в 1974 г. предложил определение эксперимента на животных: «Экспериментом на животных можно считать любой эксперимент, проводимый на самом животном или при его частичном участии, в ходе которого происходит сбор информации, результатов или проверка эффекта какого-либо процесса на животном». Лабораторное животное приносится в жертву ради блага человека и науки [8].
Безопасность и эффективность лекарственных препаратов оценивается по соотношению пользы от его применения и риска развития нежелательных или токсических эффектов. На стадии экспериментальных (доклинических) исследований об эффективности и безопасности лекарственного средства можно судить по соотношению фармакологически активных и токсических доз препарата в исследованиях на животных. На стадии клинических исследований о безопасности лекарственного препарата говорит его высокая эффективность при хорошей переносимости. Каждый лекарственный препарат является потенциальным ядом, если его использовать не в соответствии с инструкцией по применению, которая была создана на основании его доклинических и клинических исследований. Обязательным условием оценки безопасности и эффективности лекарственных препаратов на стадии доклинических исследований является проведение их в условиях надлежащей лабораторной практики (GLP). Только соблюдение правил GLP, а именно проведение исследований на здоровых животных, качественное их содержание, определение состояния гомеостаза животных в соответствии со стандартными операционными процедурами (СОП) и применение современных статистических методов оценки получаемых результатов, позволит иметь достоверную экспериментальную оценку безопасности и эффективности лекарственного препарата [7, 15].
Принципы GLP определены как система обеспечения качества, касающаяся организационного процесса и условий, в которых неклинические исследования медицинской и экологической безопасности должны быть спланированы, выполнены, проконтpолиpованы, оформлены и заархивированы. Принципы GLP предназначены для обеспечения согласованности и достоверности результатов неклинических исследований медицинской и экологической безопасности. Принципы GLP направлены на обеспечение приемлемости результатов научных исследований.
Клинические исследования, проведенные в соответствии с правилами надлежащей клинической практики (GCP), установят безопасность и эффективность для человека лекарственного средства. Принципы оценки безопасности и эффективности лекарственных препаратов различаются в зависимости от объекта исследования [7].

Программа доклинического изучения лекарственных средств для медицинского применения

В научно-исследовательском центре «Парк активных молекул», г. Обнинск для каждого инновационного лекарственного препарата разрабатывается программа их доклинического изучения в соответствии с современными требованиями нормативно-правовых актов и методической базы, регламентирующих исследования безопасности и эффективности лекарственных средств в Российской Федерации. В соответствии с этими программами в настоящее время проведены доклинические исследования следующих инновационных лекарственных препаратов для медицинского применения:
  - противогриппозного средства [17];
  - средства для лечения мужского и женского бесплодия;
  - противоопухолевого средства;
  - радиопротекторного средства;
  - средства для лечения деменции различной этиологии;
  - противодиабетические средства;
 - универсального кровезаменителя при острой постгеморрагической анемии.

При разработке программ и проведении доклинических исследований инновационных препаратов основывались на следующей методической базе:
 - Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова - М.: Гриф и К, 2012;
 - Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / Под ред. А.Н. Миронова - М.: Гриф и К, 2012;
 - Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева - М., 2005.

Доклинические исследования были проведены с учетом требований действующих на территории Российской Федерации законов, приказов и нормативных документов Министерства здравоохранения:
  -       Федеральный закон от 12.04.2010 N 61-ФЗ (ред. от 02.08.2019) "Об обращении лекарственных средств".
  -       ГОСТ Р 33044-2014 (Межгосударственный стандарт) «Принципы надлежащей лабораторной практики» (OECD Guide 1:1998, IDT).
  -       Приказ Минздрава РФ от 01.04.2016 N 199н – «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»
  -       Государственная фармакопея Российской Федерации, выпуски XII и XIII.
  -       ОСТ 91500.05.001-00 Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения
  -       ГОСТ Р 52249-2009 Правила производства и контроля качества лекарственных средств.

Программа доклинических исследований разрабатываемых лекарственных средств для медицинского применения предусматривала изучение:
  - специфической фармакологической активности;
  - фармакокинетических свойств;
  - фармакологической безопасности;
 - общетоксических свойств (острая и хроническая токсичность, местнораздражающее действие);
 - специфических видов токсичности (мутагенности и канцерогенности, репродуктивной токсичности, аллергизирующих и иммунотоксических свойств).

Все манипуляции с животными проводили в соответствии с правилами Этического Комитета.
Отчеты, составленные по результатам доклинических исследований, содержат научно-техническое обоснование выводов и рекомендаций исполнителя, подтвержденное экспериментальными данными и/или теоретическими расчетами, и соответствуют ГОСТ 7.32-2001 «Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления» [18].

Фармакодинамические исследования

Фармакодинамические исследования разрабатываемых препаратов включали исследования  их фармакологических эффектов: локализацию, механизм и виды действия. Каждое лекарственное средство вызывает характерные именно для него фармакологические эффекты. Механизмы действия лекарственных веществ определили как способы, которыми вещества вызывают фармакологические эффекты. К основным вариантам механизмов действия относятся действие на:
1) специфические рецепторы;
2) ферменты;
3) ионные каналы;
4) транспортные системы.

На основании методической базы для каждого инновационного лекарственного средства в зависимости от их назначения была разработана программа фармакодинамических исследований, и она включала:
- изучение механизма действия на клеточном, молекулярном уровне;
- оценку фармакологических эффектов ФС и ГЛФ препаратов в in vitro и in vivo модельных экспериментах (спектр противоопухолевой активности – на перевиваемых опухолях, в культуре опухолевых клеток; противовирусная активность - на модели гриппозной пневмонии мышей; противодиабетическая активность – на стрептозотоциновой модели сахарного диабета; антиамнестическая активность – на различных моделях нарушений ЦНС и другие).

Фармакологическая безопасность

В соответствии с программой исследования были изучены фармакодинамические эффекты, не связанные с заявленным показанием к применению – влияние препаратов на сердечно-сосудистую, центральную нервную, дыхательную системы, желудочно-кишечный тракт, биохимические и гематологические показатели крови.

Изучение влияния биологически активных веществ на функцию ЦНС осуществляется различными методами. Наиболее распространенными и общепринятыми являются нейрофармакологические и поведенческие методы. Для исследования влияния препаратов на функцию ЦНС использовались нейрофармакологические методы, а именно методы фармакологических анализаторов, основанные на фундаментальном принципе физиологии, согласно которому физиологическая реакция зависит не только от силы воздействия (в данном случае дозы фармакологического агента), но, в значительной мере, от исходного функционального состояния ЦНС. Были проведены исследования влияния препаратов на основные нейромедиаторные системы головного мозга лабораторных животных (холин-, дофамин-, серотонин- и ГАМК-ергическую) и чувствительность ЦНС животных к действию судорожных агентов (стрихнин, коразол) и наркотических веществ (гексенал, тиопентал-натрий, этанол).

На основании проведенных исследований фармакологии безопасности можно заключить, что разрабатываемые препараты в терапевтических дозах, рекомендованных для человека и превышающих их в 10 и 20 раз, существенно не влияют на М и Н холинэргическую, серотонинэргическую и дофаминэргическую системы ЦНС, не оказывает отрицательного действия на безусловные рефлексы, мышечную силу, координацию движений, ориентировочно-исследовательскую реакцию, условные рефлексы и процесс обучения. Общее состояние и поведение не вызывает существенных изменений показателей электрокардиограммы, артериального давления, частоты сердечных сокращений и дыхания, не воздействует на эвакуаторную активность желудка и перистальтику тонкого кишечника, функцию почек, печени, углеводный и липидный обмен и тем самым не изменяет функциональное состояние важнейших органов и систем организма подопытных животных.

Фармакокинетические исследования

Изучение фармакокинетики – кинетики всасывания, распределения и элиминации фармакологических средств в организме является составной частью доклинических исследований. Для оригинальных фармакологически активных веществ, ранее не применявшихся в качестве фармакологических средств, фармакокинетические исследования проводятся в полном объеме. Целью исследования фармакокинетики фармакологического средства является количественная характеристика процессов его всасывания, распределения и элиминации (метаболизм и экскреция). Знание фармакокинетических свойств фармакологического средства позволяет обосновать выбор путей и методов его введения, выявить ткани, в которые оно проникает наиболее интенсивно и/или удерживается наиболее длительно, установить основные пути элиминации. Важней задачей изучения фармакокинетики оригинального фармакологического средства является оптимизация его лекарственной формы. Для фармакокинетических исследований в качестве экспериментальных моделей применяются крысы, кролики, собаки, обезьяны. Необходимо использовать не менее двух видов животных, один из которых не относится к грызунам [1, 13, 14].

Для инновационных фармацевтических субстанций (ФС) и готовых лекарственных форм (ГЛФ) нами была разработана программа доклинических исследований фармакокинетики и она включала:
 - исследование фармацевтической субстанции на панели АДМЕ (абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция); проведение in vitro исследования термодинамической растворимости, связывания с белками плазмы крови, метаболизма, ингибирования активности цитохромов и Pgp-субстратной специфичности разрабатываемого фармакологического средства.
- исследование фармакокинетики ГЛФ при введении крысам в виде капсульной массы. Определение абсолютной биодоступности и линейности фармакокинетики ГЛФ при введении фармацевтической субстанции крысам внутривенно в одной дозе и внутрижелудочно в виде капсульной массы в трех дозах по ФС.
 - изучение фармакокинетики ГЛФ при многократном внутрижелудочном ежедневном в течение 5 дней введении крысам в одной дозе по ФС. 
- экспериментальное исследование экскреции и распределение фармацевтической субстанции по органам и тканям у крыс при внутрижелудочном однократном введении ФС в одной дозе 50.
- исследование фармакокинетики и абсолютной биодоступности ГЛФ в капсулах после однократного внутривенного введения ФС в одной дозе и однократного перорального введения ГЛФ собакам в двух дозах.
- изучение фармакокинетики ГЛФ при многократном пероральном ежедневном в течение 5 дней введении собакам в одной дозе по ФС.

В ходе исследований была проверена способность ФС ингибировать активность цитохромов печени человека, идентифицирован цитохром, преимущественно ее метаболизирующий, изучено, является ли ФС субстратом для Pgp-транспортера, связывание с белками плазмы и растворимость. Знание особенностей метаболизма лекарственного средства определенными изоформами системы цитохрома Р450 является необходимым при прогнозировании возможных нежелательных явлений, вызванных межлекарственными взаимодействиями.

Токсикологические исследования

Как указывалось выше, оценка безопасности инновационного лекарственного препарата на стадии доклинических исследований должна включать в себя изучение на экспериментальных животных его общетоксического действия, специфических видов токсичности. Определяются органы, наиболее чувствительные к препарату (органы-мишени), дозовая зависимость выявленной патологии и степень ее обратимости [9, 16].

На основании полученных данных по токсикологическому профилю препарата рассчитывается безопасная доза для человека при проведении 1-й фазы клинических исследований, когда препарат назначается волонтеру впервые. На этой фазе клинических исследований необходимо проводить мониторинг функционального состояния тех органов, которые были определены как органы-мишени у животных. При проведении 2-й фазы клинических испытаний большое значение имеют результаты переносимости препарата волонтерами (1-я фаза клинических испытаний), а также анализ данных токсикологических исследований на животных с учетом патологических процессов, развивающихся у пациентов при соответствующих заболеваниях. Оцениваются соотношение ожидаемой пользы от применения препарата в клинике и риск возможных нежелательных реакций [7].

Ниже представлена программа доклинических токсикологических исследований инновационных лекарственных средств, разрабатываемых НИЦ ПАМ.

Название препаратов

Высшая терапевтическая доза - мг/человека/сутки

Способ введения - перорально, парантерально

Продолжительность курса

Повторные курсы - возможны (не возможны)

Паспорт - (соответствие ФСП, физико-химические свойства, как стерилизовать, как и в чем растворять, как хранить)

Программа предусматривает изучение общетоксического действия препарата и специфических видов его токсичности.

1.   Изучение токсичности и переносимости препарата при однократном введении лабораторным животным (острая токсичность)

При выборе дозировок для исследования острой системной токсичности целесообразно использовать достаточное их количество с целью оценки состояния гомеостаза животных, а не только летальности. Дозы подбирают с учетом величины дозы, проявившей фармакологическую активность на том же виде животных. До недавнего времени считалось, что максимальная доза не должна превышать 2 г/кг, в настоящее время этот порог снижен до 1,5 г /кг. Кроме того максимальную дозу определяют как дозу не более в 100-300 раз выше ожидаемой дозы для человека.

Но этот постулат часто не выполним, поскольку доза для человека инновационного лекарственного средства определяется по совокупности результатов изучения острой и хронической токсичности. Считается, что эффекты при высоких дозах могут маскировать эффекты, которые наблюдались бы при низких дозах. Поскольку люди с большей вероятностью будут принимать препарат в более низких дозах, чем экспериментальные животные, эти «низкодозированные» эффекты могут быть важными параметрами для определения безопасности лекарственного средства [7, 19, 20].

Исследование проводили на мышах, крысах и кроликах.

На 1-ом этапе этих исследований для определения ориентировочной ЛД50 препараты вводились (2 способа введения) отдельным животным в увеличивающихся на 50% дозах (метод Дейхмана и Лебланка).

На 2-ом этапе исследований препараты вводились группам животных (по 5-7 мышей и крыс в каждой) в дозах меньшей, равной и превышающей установленную ориентировочную ЛД50.

Длительность периода наблюдения за животными после введения 2 недели, в течение которого проводился учет погибших и выживших животных. Для установления точных параметров токсичности препаратов на 2-ом этапе исследований применялся «метод пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону».

На 3-м этапе исследований препараты вводились кроликам (5 кроликам) в дозах, превышающих высшую терапевтическую дозу для человека в 10 и 20 раз. До введения препаратов (фон), а также через 4 и 24 часа после их назначения анализируются  гематологические и биохимические показатели крови. Также оценивается общее состояние и поведение подопытных животных.

2. Изучение токсичности фармацевтической субстанции препаратов в условиях хронического эксперимента на крысах (3-6 месяцев)

После окончания адаптационного периода у крыс (самцы и самки) определения массы тела, а также фоновых гематологических и биохимических показателей, характеризующих систему кроветворения, основные виды обмена, функциональное состояние важнейших органов и систем организма подопытных животных методом случайных чисел формировались следующие группы животных по 20 животных в каждой:
1  группа - контроль
2  группа - препарат 5 или 10-кратная терапевтическая доза
3  группа - препарат 20 или 50-кратная терапевтическая доза

Испытуемые дозы препаратов в 5 или 10 и 20 или 50 раз превышали терапевтическую дозу для человека. Фармацевтическая субстанция препаратов внутрижелудочно вводились животным в указанных дозах один раз в сутки.

Динамические исследования гематологических и биохимических показателей были проведены до и через 1, 3 и 6 месяцев назначения препаратов.

После окончания хронических экспериментов проводилась эвтаназия крыс с последующим патоморфологическим (макро- и микроскопическим) исследованием их внутренних органов.

3. Изучение токсичности готовой лекарственной формы препаратов в условиях 1 или 3- месячного хронического эксперимента на собаках

После снятия фоновых гематологических и биохимических показателей и массы тела, формируются 3 группы по 5 животных:
1       группа – контроль
2       группа - препарат 5 или 10-кратная терапевтическая доза
3       группа - препарат 20 или 50-кратная терапевтическая доза

Исследование гематологических и биохимических показателей проводилось до и через 1 и 3 месяцев назначения препарата. Препараты  вводились перорально. После окончания эксперимента была проведена эвтаназия животных с последующим патоморфологическим исследованием внутренних органов.

4. Исследование мутагенных свойств ФС препаратов

Программа доклинического исследования специфических видов токсичности ФС  на 1 этапе включала изучение мутагенных и прогноз канцерогенных свойств: оценку мутагенных свойств ФС на микроорганизмах в тесте Эймса; влияние ФС на индукцию доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей; влияние ФС на индукцию хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей; влияние ФС на индукцию ДНК-повреждений методом ДНК-комет.

4.1. Изучение мутагенных свойств препаратов на микроорганизмах в тесте Эймса

Оценка мутагенной активности препаратов проводилась методом учета способности препарата индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium в системе метаболической активации in vitro и без системы метаболической активации. Заключение о наличии мутагенного действия препаратов выносилось при наличии обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности.

4.2.     Исследование   влияния  препаратов  на   аберрации  хромосом   в клетках костного мозга мышей

Сущность метода заключалась в оценке влияния введенного в организм животных изучаемых препаратов на чувствительный к воздействиям химических веществ и физических факторов генетический аппарат клеток костного мозга.

Исследование цитогенетической активности препаратов методом учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей проводилось на мышах.

При проведении исследований препаратов внутрижелудочно вводились 2 группам мышей по 5 животных в каждой: 1 группа - однократно в 50-100 кратной терапевтической дозе, рекомендованной для человека, 2 группа - 5-кратно (в течение 5 дней) в 10-кратной терапевтической дозе для человека.

4.3.     Изучение  влияния ФС препаратов   на   индукцию   доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей

Данный тест необходим для того, чтобы определить, вызывают ли препараты увеличение количества летальных мутаций в половых клетках самцов мышей, получавших препарат на различных стадиях сперматогенеза.

Подопытной группе мышей-самцов внутрижелудочно однократно  вводились препараты в дозе, в 100 раз превышающей терапевтическую дозу для человека. На следующие сутки после введения препаратов к каждому самцу были подсажены по 3 интактных виргинных самки. Через каждые 7 дней самки отсаживались, заменяя их новыми. Отсаженные самки вскрывались на 15-17 дни беременности, и учитывалось количество живых и мертвых эмбрионов. Повышенная эмбриональная смертность плодов у самок, забеременевших в первую неделю после введения препаратов, свидетельствовала о мутационных изменениях в зрелых спермиях, во 2-ю неделю - поздних сперматидах и в 3-ю - в ранних сперматидах. Показателям уровня доминантных летальных мутаций служил уровень постимплантационных потерь.

4.4.     Изучение  влияния ФС препаратов  на индукцию ДНК-повреждений методом ДНК-комет в лимфоцитах крыс

Метод основан на регистрации подвижности в постоянном электрическом поле ДНК и/или фрагментов ДНК клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, длина и содержание ДНК в котором зависят от количества одно- и двунитевых разрывов ДНК и щелочно-лабильных сайтов. Метод позволяет оценивать повреждения ДНК на уровне отдельных клеток, обладает высокой чувствительностью, требует минимального количества экспериментального материала, применим ко всем типам клеток.

Следует подчеркнуть, что использованные методы учета мутаций являются первым этапом оценки канцерогенности и в случае получения отрицательных результатов дальнейшее изучение канцерогенных свойств препаратов не целесообразно в связи с малой вероятностью обнаружения нежелательной активности.

5. Исследование репродуктивной токсичности ФС препаратов

Исследования по выявлению репродуктивной токсичности включали:
- изучение влияния на репродуктивную (генеративную) функцию;
- изучение эмбрио- фетотоксического действия, регистрируемого в антенатальном периоде развития;
- изучение эмбрио- фетотоксического действия, регистрируемого в постнатальном периоде развития.

5.1. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств ФС

Эксперименты проводились на беременных крысах Wistar, кото­рые были разделены на 3 группы: 1-я группа - контроль, 2-я группа - препараты в дозе, равной 10-кратной терапевтической дозе для человека, 3-я группа - препараты в дозе, равной 20 кратной терапевтической дозе для человека.

Препараты вводились внутрижелудочно животным 1 раз в сутки с 1 по 19 день беременности.

На 20-й день беременности была проведена эвтаназия 70% беременных крыс дислокацией шейных позвонков с последующим исследованием костного скелета и внутренних органов плодов, а также определены показатели предимплантационной и постимплантационной гибели крысят.

30% от общего количества беременных самок было оставлено на роды, по­сле которых в течение первого месяца постнатального периода проведено изучение смертности, динамики массы тела и физического развития крысят.

5.2.   Изучение влияния ФС  на репродуктивную функцию у крыс

Группы самцов и самок были разделены на 2 подгруппы: контрольную и опытную. Самцам опытной подгруппы ежедневно один раз в сутки в течение 10 недель (2-3- цикла созревания сперматозоидов) внутрижелудочно вводились препараты в дозе, равной 10-кратной терапевтической дозе для человека. Самкам опытной подгруппы также внутрижелудочно вводились препараты в той же дозе в течение 2 недель (3-4 эстральных цикла).

После окончания введения препаратов формировались 3 группы животных:
Первая -  к контрольным самцам подсаживали контрольных самок
Вторая - к подопытным самцам подсаживали контрольных самок
Третья - к подопытным самкам подсаживали контрольных самцов.

По истечении 10 дней из беременных самок в каждой из 3 групп было со­здано две подгруппы.

Первые подгруппы самок вскрывали на 20-й день беременности. Определяли показатели пред- и постимплантационной гибели, индексы плодови­тости и беременности, а также учитывались аномалии и пороки развития.

Вторые подгруппы беременных самок были оставлены на роды. Регистрировались прибавка массы тела беременных крыс, сроки родов, количество и масса тела новорожденных крысят, а также учитывались аномалии и пороки развития.

На основании полученных данных было сделано заключение о возможном влиянии препаратов на репродуктивную функцию у самцов и самок крыс.

            6.  Исследование аллергизирующих свойств ФС и ГЛФ препаратов

6.1. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на морских свинках

Исследования проводились на морских свинках, разделенных на 3 группы: 1 группа - контроль, 2 группа - ФС (терапевтическая доза или 5- кратная доза), 3 группа - ФС (10-кратная доза). Указанные дозы препаратов соответствовали терапевтической дозе, рекомендованной для человека и 5 и 10-кратно превышали ее. Аналогичные группы морских свинок были сформированы для исследования ГЛФ препаратов.

Проведена сенсибилизация морских свинок 2-й и 3-й групп однократным введением в подушечки 4-х лап препаратов в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Разрешающие дозы препаратов вводились животным через 20 дней после их сенсибилизации. Для контроля реактивности вводилась дистиллированная вода. Реакция гиперчувствительности замедленного типа оценивалась по шкале кожных проб Г.В. Суворова через 1, 24 и 48 часов после нанесения разрешающих доз препаратов.

6.2.    Изучение анафилактогенной активности препаратов

 Исследования проводились на морских свинках, разделенных на 3 группы: 1 группа - контроль, 2 группа – ФС, 1-кратая доза, 3 группа - ФС, 10-кратная терапевтическая доза. Указанные дозы препарата соответствовали высшей и 10-кратной высшей суточной дозам, рекомендованным для человека. Аналогичные группы морских свинок были сформированы для исследования ГЛФ препаратов.

Животных сенсибилизировали 5-кратным с интервалом в 1 день внутрибрюшинным введением препаратов в указанных выше дозах. Контрольные животные получали соответствующие количества физиологического раствора. Тест-инъекции (разрешающие дозы) препаратов и физиологического раствора вводились внутрибрюшинно на 14 и 21 дни после последней сенсибилизации.

6.3. Метод накожных аппликаций

Исследования проведены на пестрых морских свинках с большими белыми участками кожи, разделенных на 3 группы: 1 группа - контроль, 2 группа - ФС (1-кратная), 3 группа - ФС (10-кратная доза). Используемые дозы препаратов соответствовали высшей и 10-кратной высшей суточной дозе для человека. Аналогичные группы морских свинок были сформированы для исследования ГЛФ препаратов.

Препараты наносились на выстриженные белые участки кожи подопытных животных 5 раз в неделю в течение 2-х недель. Контрольным морским свинкам в те же сроки наносили физиологический раствор. Реакция кожи на препарат учитывались ежедневно по шкале проб СВ. Суворова.

6.4.  Исследование влияния  ФС и ГЛФ  на массу и клеточность подколенного лимфоузла  у мышей

Для изучения аллергизирующих свойств ФС и ГЛФ препаратов был применен метод оценки изменения массы и клеточности подколенного лимфоузла у мышей в ответ на антигенный раздражитель, так называемый «popliteal lymph node assay» , PLNA [10, 12]. Этот метод широко используется для прогноза аллергизирующих свойств лекарственных препаратов.

Исследования проведены на мышах, которым в подушечку правой задней лапы вводился физиологический раствор. В подушечку контрлатеральной лапы вводились ФС и ГЛФ препаратов, первоначально растворенных в физиологическом растворе. Через 7 дней у мышей определялась масса и клеточность подколенных лимфоузлов.

7. Изучение иммунотоксических свойств ФС и ГЛФ препаратов

Исследование влияния ФС и ГЛФ препаратов на гуморальный иммунный ответ  изучалось с помощью метода оценки действия препаратов на число антителообразующих клеток в селезенке по Ерне. Влияние ФС и ГЛФ препаратов на клеточный иммунитет исследовалось с помощью реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Кроме того, согласно рекомендациям Рабочего совещания в Арлингтоне [11] исследовалось влияние ФС и ГЛФ препаратов на клеточность селезенки на фоне антигенного стимула.

7.1. Оценка влияния ФС и ГЛФ  на число антителообразующих клеток в селезенке.

Для изучения влияния ФС и ГЛФ препаратов на число антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей использовался прямой метод локального гемолиза, который позволяет определить клетки, образующие иммуноглобулин М-антитела с высокой гемолитической активностью.

Исследования были выполнены на мышах, разделенных на 7 групп. Мыши были иммунизированы внутривенным введением эритроцитов барана (ЭБ), отмытых в стерильном физиологическом растворе в оптимальной иммуногенной дозе 5x108 клеток/мышь.

Мышам групп 1 и 2 за сутки до иммунизации ЭБ внутрижелудочно  вводился ФС в дозах 1 и 2, равных высшей и 10-кратной высшей терапевтической дозе, мышам групп 3 и 4 - в дозах 1 и 2 соответственно в день иммунизации (через 1 час после иммунизации, день "0"). Животные групп 5 и 6 получали внутрижелудочно ФС в дозах 1 и 2 соответственно через 24 часа после иммунизации ЭБ (день "+1"). Мыши 7 группы служили контролем и получали в день "+1" внутрижелудочно физиологический раствор в таком же объеме. Испытуемые дозы ФС соответствовали высшей и 10-кратной высшей суточной дозе для человека. Аналогичные группы мышей были сформированы для исследования ГЛФ препаратов.

7.2. Изучение влияния ФС и ГЛФ на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей

Исследования проведены на мышах, которые были разделены на 7 групп. Мышей иммунизировали подкожным введением в межлопаточную область эритроцитов барана в дозе 2x108 клеток/мышь. Мышам 1 и 2 групп за сутки до иммунизации ЭБ (день «-1») внутрижелудочно вводилась ФС в дозах 1 и 2 . Мышам групп 3 и 4 ФС вводилась внутрижелудочно в дозах 1 и 2 через 1 час после иммунизации ЭБ (день «О»). Дозы 1 и 2 соответствовали высшей и 10-кратной высшей терапевтической дозе, рекомендованной для человека. Животным 5 и 6 групп ФС вводилась в тех же дозах через 24 часа после инъекции антигена (ЭБ, день «+1»). Контрольные мыши (группа 7) внутрижелудочно получали соответствующие количества физиологического раствора. Аналогичные группы мышей были сформированы для исследования ГЛФ препаратов.

На 5-е сутки после иммунизации все животные получали субплантарно в левую заднюю лапу разрешающую инъекцию ЭБ в дозе 1x108 клеток/мышь в объеме 50 мкл («опытная лапа»). В подушечку контралатеральной лапы («контрольная лапа») инъецировали 50 мкл стерильного физиологического раствора. Результаты реакции оценивались через 24 часа по разнице массы «контрольной» и «опытной» лап, которая характеризует величину отека и интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа.

7.3. Оценка влияния ФС и ГЛФ  на массу и клеточность селезенки на фоне иммунного стимула

Исследования проведены на мышах, которые были разделены на 7 групп. Мышей предварительно иммунизировали внутривенным введением эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 5x108 клеток/мышь. Мышам 1 и 2 групп внутрижелудочно вводилась ФС за сутки до иммунизации ЭБ (день -1). Мыши 3 и 4 групп получали внутрижелудочно ФС через 1 час после иммунизации (день «0»). Животные 5 и 6 групп получали внутрижелудочно ФС через 24 часа после иммунизации ЭБ (день «+1»). Мыши 7 группы были контролем и получали внутрижелудочно физиологический раствор в тех же объемах. Испытуемые дозы ФС соответствовали высшей и 10-кратной высшей суточной дозе, рекомендованной для человека. Аналогичные группы мышей были сформированы для исследования ГЛФ препаратов.

На 4 сутки после иммунизации мышей была определена масса селезенки и количество в ней ядросодержащих клеток, по которым оценивалось влияние ФС и ГЛФ препаратов на иммунный ответ.

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ:

1. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Под ред. А.Н. Миронова – М.: Гриф и К, 2012. – 944 с.
2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / Под ред. А.Н. Миронова - М.: Гриф и К, 2012. – 536 с.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева.-2-изд., перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005.- 832 с.: ил.
4. Федеральный закон от 12.04.2010 N 61-ФЗ (ред. от 02.08.2019) «Об обращении лекарственных средств».
5. ГОСТ Р 33044-2014 (Межгосударственный стандарт) «Принципы надлежащей лабораторной практики» (OECD Guide 1:1998, IDT).
6. Приказ Минздрава РФ от 01.04.2016 N 199н – «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»
7. Безопасность лекарств: от доклиники к клинике: монография / Т.А. Гуськова, А.Л. Хохлов, Б.К. Романов, Р.Н. Аляутдин, О.А. Синицина, С.А. Спешилова, М.К. Корсаков, Т.Н. Николаева, С.В. Романова, Н.В. Чудова; под ред. А.Л. Хохлова. – Москва-Ярославль: ООО «Фотолайф», 2018, - 275 с.
8. Мутова Т.В., Цымбалюк В.В., Затолокина Е.С. Биоэтические аспекты в исследовании особенности реакции тканей при герниопластике// Материалы межрегиональной научной конференции «Этико-правовые аспекты биомедицинских эксперимнтов» Под редакцией В.А. Лазаренко. 2018. – С. 37-39.
9. Культура безопасности лекарственной терапии / А.Л. Хохлов [и др.]. – Ярославль, 2011. – 156 с.
10. Principes and methods for assessing direct immunotoxicity associated with exposure to chemicals. Enviromental Health Criteria, Vol.180 WHO, 1996.
11. Neuman D.A. Immunotoxicity testing and risk asessment: Summary of 1994 Workshop Immunology Technical Committee.-Fd Chem.Toxic,1995, Vol 33, №10, рр. 887-894
12. Descotes J, Verdier F., Popliteal lymph node assay. In Methods in immunotoxicity. Vol.1, (eds. Burlenson J.R., Dean J.N., Munson A.E.), Wiley – Liss inc., 1995, pp.189-196.
13. Мирошниченко И.И. Основы фармакокинетики. – М.: Издательский дом ГЭОТАР-Медиа, 2002. – 192 с.: ил.
14. Мирошниченко И.И. Рациональное дозирование и мониторинг лекарственных средств: Практическое руководство.- М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агенство», 2011. – 416 с.: ил.
15. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP) РД 64-126-9. Второе издание / Ю.В. Буров, И.В. Березовская, Г.Н. Золотарева, А.С. Кинзирский, Г.П. Кудрина, Г.А. Пенязева/ -М.: Центр по биотехнологии, медицине и фармации, 2000, 80 с.
16. Токсикология лекарственных средств. Издание второе дополненное / Т.А. Гуськова/ -М.: МДВ, 2008. – 196 с.
17. Еримбетов К.Т., Бондаренко Е.В., Калашникова Е.В., Гончарова А.Я.. Исследование токсичности оригинального противогриппозного препарата Бенкармет при однократном введении мелким лабораторным животным // Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием «Химическая безопасность и токсикология на стыке областей наук». Кишинев, 2016. С. 23-25.
18. ГОСТ 7.32-2001. Отчет о научно-исследовательской работе.
19. Дорожкин В. И., Бирюкова Н. П., Бахмутова Т. В. Современные требования к изучению общетоксического действия фармакологических веществ // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии № 2(30), 2019. – с. 205-215.
20. Shayne Cox Gad. Pilot toxicity testing in drag safety evaluation: MTD and DRF.// Drug Safety Evaluation, Third Edition, 2017 p. 129-157.

Скачать статью (569 КБ)